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實驗室常用微生物菌種的分離和純化方法

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。在分子生物學的研究及應用中，不僅需要通過分離純化技術從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”，防止其他微生物的混入。

1、用固體培養(yǎng)基分離和純化

單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結構的子細胞生長群體，稱為菌落。當固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時，便成為菌苔。不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征，可以成為對該微生物進行分類、鑒定的重要依據。大多數細菌、酵母菌、以及許多真菌和單細胞藻類能在固體培養(yǎng)基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養(yǎng)。所謂平板，即培養(yǎng)平板的簡稱，它是指固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛固體培養(yǎng)基的平皿。這方法包括將單個微生物分離和固定在固體培養(yǎng)基表面或里面。固體培養(yǎng)基用瓊脂或其它凝膠物質固化的培養(yǎng)基，每個孤立的活微生物體生長、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。zui常用的分離、培養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養(yǎng)的技術簡便易行，100多年來一直是各種菌種分離的zui常用手段。

1.1 稀釋倒平板法

首先把微生物懸液作一系列的稀釋（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時間即可出現菌落。如果稀釋得當，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落，或重復以上操作數次，便可得到純培養(yǎng)。

1.2 涂布平板法

因為將微生物懸液先加到較燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長，因此在微生物學研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的微生物懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面，經培養(yǎng)后挑取單個菌落（圖1）。

圖1 涂布平板法

1.3 平板劃線法

zui簡單的分離微生物的方法是平板劃線法，即用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行連續(xù)劃線（圖2），微生物細胞數量將隨著劃線次數的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。有時這種單菌落并非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反復分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的的。劃線的方法很多，常見的比較容易出現單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。

圖2 平板劃線法

1.4 稀釋搖管法

用固體培養(yǎng)基分離嚴格厭氧菌有特殊性，如果該微生物暴露于空氣中不立即死亡，可以采用通常的方法制備平板，然后置放在封閉的容器中培養(yǎng)，容器中的氧氣可采用化學、物理或生物的方法清除。對于那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養(yǎng)的分離則可采用稀釋搖管培養(yǎng)法進行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式。先將一系列盛無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基和空氣隔開。培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間。進行單菌落的挑取和移植，需先用一只滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用一只毛細管插入瓊脂和管壁之間，吹入無菌無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養(yǎng)皿中，用無菌刀將瓊脂柱切成薄片進行觀察和菌落的移植。

2、用液體培養(yǎng)基分離和純化

大多數細菌和真菌，用平板法分離通常是滿意的，因為它們的大多數種類在固體培養(yǎng)基上長得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養(yǎng)基上生長，例如一些細胞大的細菌、許多原生動物和藻類等，這些微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。

稀釋法是液體培養(yǎng)基分離純化常用的方法。接種物在液體培養(yǎng)基中進行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個微生物。如果經稀釋后的大多數試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。如果經稀釋后的試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養(yǎng)物的機率就會急劇下降。因此，采用稀釋法進行液體分離，必須在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數（一般應超過95%）表現為不生長。

3、單細胞（孢子）分離

只能分離出混雜微生物群體中占數量優(yōu)勢的種類是稀釋法的一個重要缺點。在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數。這時，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)，稱為單細胞（或單孢子）分離法。單細胞分離法的難度與細胞或個體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動物較容易，個體很小的細菌則較難。

較大的微生物，可采用毛細管提取單個個體，并在大量的滅菌培養(yǎng)基中轉移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進行。對于個體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。在沒有顯微操作儀時，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進行單細胞分離，例如將經適當稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取只含一個細胞的液體來進行純培養(yǎng)物的分離。單細胞分離法對操作技術有比較高的要求，多限于高度專業(yè)化的科學研究中采用。

4、選擇培養(yǎng)分離

沒有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)條件能夠滿足一切微生物生長的需要，在一定程度上所有的培養(yǎng)基都是選擇性的。如果某種微生物的生長需要是已知的，也可以設計特定環(huán)境使之適合這種微生物的生長，因而能夠從混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養(yǎng)出來，盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只占少數。這種通過選擇培養(yǎng)進行微生物純培養(yǎng)分離的技術稱為選擇培養(yǎng)分離，特別適用于從自然界中分離、尋找有用的微生物。自然界中，在大多數場合微生物群落是由多種微生物組成的，從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當某一種微生物所存在的數量與其它微生物相比非常少時，單采用一般的平板稀釋法幾乎是不可能的。要分離這種微生物，必須根據該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等，采用選擇培養(yǎng)分離的方法?；蛞种剖勾蠖鄶滴⑸锊荒苌L，或造成有利于該菌生長的環(huán)境，經過一定時間培養(yǎng)后使該菌在群落中的數量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純培養(yǎng)分離。

4.1 利用選擇平板進行直接分離

根據待分離微生物的特點選擇不同的培養(yǎng)條件，有多種方法可以采用。例如要分離高溫菌，可在高溫條件下進行培養(yǎng)；要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上進行分離；有些微生物如螺旋體、粘細菌、藍細菌等能在瓊脂平板表面或里面滑行，可以利用它們的滑動特點進行分離純化，因為滑行能使它們自己和其它不能移動的微生物分開。可將微生物群落點種到平板上，讓微生物滑行，從滑行前沿挑取接種物接種，反復進行，得到純培養(yǎng)物。

4.2 富集培養(yǎng)

富集培養(yǎng)法原理和方法非常簡單，利用不同微生物間生命活動特點的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應于該條件的微生物旺盛生長，從而使其在群落中的數量大大增加，很容易地分離到所需的特定微生物。富集條件可根據所需分離的微生物的特點從物理、化學、生物、及綜合多個方面進行選擇，如溫度、pH、紫外線、高壓、光照、氧氣、營養(yǎng)等等許多方面。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經過多次重復移種，zui后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞群體中，使其大量生長。通過多次重復移種便可以得到純的寄生菌。

5、二元培養(yǎng)物

分離的目的通常是要得到純培養(yǎng)。然而，在有些情況下這是很難做到的。但可用二元培養(yǎng)物作為純化培養(yǎng)的替代物。含有二種以上微生物的培養(yǎng)物稱為混合培養(yǎng)物，而如果培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意識的保持二者之間的特定關系的培養(yǎng)物稱為二元培養(yǎng)物。例如二元培養(yǎng)物是保存病毒的zui有效途徑，因為病毒是細胞生物的嚴格的細胞內寄生物。有一些具有細胞的微生物也是嚴格的其它生物的細胞內寄生物，或特殊的共生關系。對于這些生物，二元培養(yǎng)物是在實驗室控制條件下可能達到的zui接近于純培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。另外，獵食細小微生物的原生動物也很容易用二元培養(yǎng)法在實驗室培養(yǎng)，培養(yǎng)物由原生動物和它獵食的微生物二者組成。例如，纖毛蟲、變形蟲和粘菌。

在以上介紹的幾種方法中，平板分離法普遍用于實驗室微生物的分離與純化。微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落，通常是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術完成。值得指出的是，從微生物群體中經分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。